Photosynthesis and photoprotection in Tisochrysis lutea, from synthesis to extraction of fucoxanthin

Table of Contents

• Remerciements 7
• Table des figures 18
• Table des tableaux et tables 26
• Table des annexes 28
• Liste des principales abréviations 30
• Chapitre 1 – Introduction et état de l’art 34
• 1. Les microalgues 34
• 1.1. Origine, diversité et rôle écologique 34
• 1.2. Utilisation des microalgues 36
• 1.3. Culture de microalgues 38
• 1.3.1. Les principaux paramètres de culture 38
• 1.3.2. La limitation en azote et en phosphore chez les microalgues photoautotrophes 39
• 1.3.3. Les systèmes de culture 41
• 1.3.4. Les modes de culture 42
• 1.4. Le modèle d’étude : Tisochrysis lutea 43
• 2. La photosynthèse et les pigments 45
• 2.1. Le processus photosynthétique 45
• 2.1.1. La conversion d’énergie 45
• 2.1.2. Le rôle des pigments 46
• 2.2. Le thylakoïde et les réactions claires 49
• 2.2.1. L’antenne collectrice de lumière et la FCP 50
• 2.2.2. Le photosystème II (PSII) 53
• 2.2.3. Le cytochrome b6/f 54
• 2.2.4. Le photosystème I (PSI) 54
• 2.3. Les pigments caroténoïdes 54
• 2.3.1. La biosynthèse des caroténoïdes 54
• 2.3.2. Les cycles des xanthophylles 57
• 2.4. Le Non Photochemical Quenching (NPQ) 58
• 3. La fucoxanthine 60
• 3.1. Présentation de la molécule 61
• 3.2. Fonction biologique 62
• 3.2.1. Chez les algues 62
• 3.2.2. Chez l’humain 64
• 3.3. Biosynthèse chez les algues 67
• 3.4. Biodisponibilité chez l’humain 70
• 3.5. La production de fucoxanthine par les algues 70
• 3.5.1. Les meilleures espèces productrices 70
• 3.5.2. Les mesures de production et productivité 73
• 3.6. Les paramètres de culture pour une synthèse optimale de fucoxanthine 74
• 3.6.1. Les photobioréacteurs, la température, le pH et la salinité 74
• 3.6.2. La lumière 76
• 3.6.3. Les nutriments 77
• 3.7. L’extraction et la purification de fucoxanthine 80
• 3.7.1. Le prétraitement aux ultrasons 80
• 3.7.2. Les solvants dits conventionnels et autres techniques 80
• 3.7.3. Les solvants biosourcés et écologiques 81
• 3.7.4. L’HPLC et les anti-solvants 83
• 3.7.5. Le système en double phase aqueuse 83
• 3.7.6. La chromatographie de partage centrifuge (CPC) 84
• 3.7.7. La stabilité de la fucoxanthine 86
• 3.8. Le marché mondial de la fucoxanthine 86
• 4. Objectifs de la thèse 89
• Chapitre 2 – La photosynthèse chez Tisochrysis lutea 94
• 1. Contexte et objectifs 94
• 2. Matériel et méthodes 95
• 2.1. Principe général de l’analyse transcriptomique 95
• 2.2. Méthode et outils utilisés 97
• 3. Résultats et discussion 98
• 3.1. Précision de la classification des gènes lhc chez les algues Chromistes 98
• 3.2. Identification des sites de fixation de la fucoxanthine et des chlorophylles 99
• 3.3. Expression des gènes lhcf, lhcr et synthèse de la fucoxanthine 99
• 3.3.1. Influence de la lumière 99
• 3.3.2. Influence de la disponibilité en azote 99
• 3.4. Expression des gènes lhcx et synthèse des pigments photoprotecteurs 100
• 4. Conclusion 100
• 5. Article : The Fucoxanthin Chlorophyll a/c-Binding Protein in Tisochrysis lutea: influence of nitrogen and light on FCP gene expression and fucoxanthin synthesis. 101
• 5.1. Abstract 101
• 5.2. Introduction 101
• 5.3. Materials and methods 104
• 5.3.1. Homologies of FCP sequences in Chromista 104
• 5.3.2. Identification of Lhcf, Lhcr and Lhcx proteins in Tisochrysis lutea proteome 105
• 5.3.3. Binding sites of Chl a, Chl c and Fx in T. lutea 105
• 5.3.4. Culture conditions 106
• 5.3.5. Intracellular N concentration, cell concentration 107
• 5.3.6. Pigment extraction and HPLC analysis 107
• 5.3.7. RNAseq 107
• 5.3.8. Statistics 108
• 5.4. Results 108
• 5.4.1. Homologous sequences in Chromista 108
• 5.4.2. Lhcf, Lhcr and Lhcx annotation in the proteome of T. lutea 109
• 5.4.3. Binding sites of chlorophylls and fucoxanthin in Lhcf proteins in T. lutea 112
• 5.4.4. Effects of nitrogen availability and light intensity on the expression of lhc genes 115
• 5.5. Discussion 123
• 5.5.1. FCP protein sequences in Chromista species 123
• 5.5.2. Biding sites of chlorophylls and fucoxanthin in Lhcf proteins in T. lutea 124
• 5.5.3. lhcf and lhcr expression and fucoxanthin synthesis 125
• 5.5.4. lhcx expression, diadinoxanthin and diatoxanthin synthesis 126
• 5.6. Conclusion 127
• 5.7. Acknowledgements 128
• Chapitre 3 – Les stratégies de photoprotection chez Tisochrysis lutea 132
• 1. Contexte et objectifs 132
• 2. Matériel et Méthodes 133
• 2.1. Turbidostat 133
• 2.2. Fabrication des capteurs de densité optique 135
• 2.2.1. Composition des capteurs 135
• 2.2.2. Principe de fonctionnement 137
• 3. Résultats et Discussion 138
• 3.1. Résultats principaux 138
• 3.1.1. Les différentes stratégies de photoprotection des souches de T. lutea 138
• 3.1.2. Les enzymes dé-époxydases et époxydases chez T. lutea 139
• 3.1.3. Le NPQ soutenu chez T. lutea 141
• 3.1.4. Le rôle des lhcx chez T. lutea 141
• 3.2. Résultats complémentaires : Les facteurs de transcription des gènes lhc 142
• 3.2.1. Identification des facteurs de transcription 142
• 3.2.2. Expression des facteurs de transcription en fonction de l’irradiance 144
• 4. Conclusion 146
• 5. Article : Light-response in two clonal strains of the haptophyte Tisochrysis lutea: evidence for different photoprotection strategies. 148
• 5.1. Abstract 148
• 5.2. Introduction 148
• 5.3. Materials and methods 151
• 5.3.1. Culture conditions 151
• 5.3.2. Chl a, cell concentration monitoring and growth rate 152
• 5.3.3. Pigment extraction and HPLC analysis 152
• 5.3.4. Chlorophyll fluorescence measurement 152
• 5.3.5. RNAseq 153
• 5.3.6. Similarity research 154
• 5.3.7. Statistics 154
• 5.4. Results 155
• 5.4.1. Photosynthetic pigments and photochemical properties 155
• 5.4.2. Photoprotective pigments and Fv/Fm 156
• 5.4.3. Expression of lhc genes 160
• 5.4.4. Expression of de-epoxidase and epoxidase genes 162
• 5.5. Discussion 165
• 5.5.1. Different photoprotection strategies in T. lutea T-5cl6 and T-4cl3 strains 165
• 5.5.2. Xanthophyll de-epoxidases and epoxidases in T. lutea 166
• 5.5.3. A sustained NPQ in T. lutea 168
• 5.5.4. The role of lhcx in T. lutea 169
• 5.6. Conclusion 171
• Chapitre 4 – La production de fucoxanthine par Tisochrysis lutea 176
• 1. Contexte et objectifs 176
• 2. Matériel et méthodes 179
• 2.1. Conditions de culture à différentes échelles 179
• 2.1.1. Banc de phénotypage : cultures de 350 mL 179
• 2.1.2. Bouteilles : cultures de 1 L 181
• 2.1.3. Ballons : cultures de 6 L 182
• 2.1.4. Scobalites : cultures de 300 L 183
• 2.2. Extraction et analyse HPLC des pigments 185
• 2.3. Traitement statistique 186
• 3. Résultats et Discussion 186
• 3.1. Influence du N et du P : cultures de 350 mL 186
• 3.1.1. Le choix des ratios N/P 186
• 3.1.2. Le suivi de la biomasse et l’assimilation de N 187
• 3.1.3. L’accumulation de fucoxanthine dans les cellules 190
• 3.2. Influence de l’intensité lumineuse : cultures de 1 L 193
• 3.3. Une plus grande échelle pour la production de fucoxanthine : cultures de 6 L 196
• 3.4. Influence d’un photobioréacteur de type scobalite : cultures de 300 L 200
• 3.5. Présence d’échinénone dans les cultures de T-4cl3 203
• 4. Conclusion 204
• Chapitre 5 – Optimisation d’un procédé d’extraction et de purification de la fucoxanthine 208
• 1. Contexte et objectifs 208
• 2. Matériel et méthodes 209
• 3. Résultats et discussion 210
• 3.1. Extraction des pigments totaux 210
• 3.2. Séparation de la fucoxanthine 210
• 3.3. Optimisation de la quantité de solvant d’extraction 212
• 4. Conclusion 212
• 5. Article : Improving the extraction and the purification of fucoxanthin from Tisochrysis lutea using centrifugal partition chromatography. 214
• 5.1. Introduction 214
• 5.2. Material and methods 216
• 5.2.1. Culture of Tisochrysis lutea and biomass harvesting 216
• 5.2.2. US-assisted extraction of pigments 216
• 5.2.3. Centrifugal partition chromatography 217
• 5.2.4. HPLC analyses 218
• 5.3. Results and Discussion 219
• 5.3.1. Characterization of the total pigments extract 219
• 5.3.2. CPC fractionation of acetone extract 220
• 5.3.3. CPC fractionation of ethanolic extract 229
• 5.3.1. Is fucoxanthin isolated from the Fucoxanthin Chlorophyll binding Protein? 233
• 5.3.2. Optimization of the solvent ratio for ethanol extraction 234
• Chapitre 6 – Discussion générale, conclusions et perspectives 239
• 1. La caractérisation de la FCP chez Tisochrysis lutea 239
• 1.1. Description générale et nomenclature 239
• 1.2. Vers une étude cristallographique de la FCP 240
• 1.3. Vers l’utilisation de CRISPR-Cas9 et de la qRT-PCR 241
• 2. L’identification de gènes candidats de la voie de biosynthèse des caroténoïdes 243
• 3. La présence d’échinénone chez Tisochrysis lutea 244
• 4. La régulation de la photoprotection chez Tisochrysis lutea 245
• 5. La montée en échelle de la production de fucoxanthine 247
• 5.1. L’importance de la disponibilité de la lumière 247
• 5.2. Vers la maîtrise du changement d’échelle 247
• 6. La Chromatographie de Partage Centrifuge 248
• 6.1. Une approche différente de la purification de fucoxanthine 248
• 6.2. Une approche d’éco-conception en extraction-purification 249
• 6.3. Vers une CPC « verte » 249
• 7. Conclusion générale de la thèse 250
• Valorisation scientifique 255
• 1. Publications dans des journaux à comité de lecture 255
• 2. Article soumis et autres 255
• 3. Présentations dans des conférences internationales 255
• 4. Présentations dans des conférences nationales 256
• 5. Autres communications 256
• Références 261
• Annexes 299